ابزار تعاملی عیب‌یابی PCR

شرح علت:

شایع‌ترین دلیل! وجود مهارکننده‌ها (اتانول، نمک) یا غلظت بسیار کم/زیاد DNA.

راه‌حل‌های عملی:

• تست نانودراپ: نسبت A260/280 باید حدود ۱.۸ باشد.
• رقیق‌سازی: نمونه را ۱:۱۰ رقیق کنید تا اثر مهارکننده‌ها کم شود.
• چک ژل: DNA الگو را روی ژل ببرید تا از عدم تخریب (Smear) مطمئن شوید.

شرح علت:

دمای ذوب (Tm) نامناسب یا تخریب پرایمرها در اثر ذوب/انجماد مکرر.

راه‌حل‌های عملی:

• طراحی مجدد: با Primer-BLAST چک کنید Tmها نزدیک به هم باشند.
• استوک جدید: از استوک اصلی پرایمر جدید استفاده کنید.

شرح علت:

آنزیم Taq به گرما حساس است. همچنین دمای Annealing ممکن است خیلی بالا باشد.

راه‌حل‌های عملی:

• زنجیره سرد: آنزیم را همیشه در فریزر ۲۰- و روی یخ استفاده کنید.
• کاهش دما: دمای اتصال را ۳-۵ درجه کاهش دهید.
• افزایش سیکل: تعداد سیکل‌ها را به ۳۵ یا ۴۰ برسانید.

شرح علت:

وقتی دما خیلی پایین باشد، پرایمرها به توالی‌های نیمه‌مشابه هم متصل می‌شوند.

راه‌حل‌های عملی:

• Gradient PCR: دما را در بازه ۵۰ تا ۶۵ درجه تست کنید.
• افزایش دما: دمای اتصال را ۱-۲ درجه بالا ببرید تا سخت‌گیری (Stringency) بیشتر شود.

شرح علت:

منیزیم (MgCl2) بیش از حد باعث پایداری اتصالات اشتباه می‌شود.

راه‌حل‌های عملی:

• کاهش منیزیم: غلظت را به ۱.۵ میلی‌مولار کاهش دهید.
• کاهش پرایمر: غلظت پرایمر را نصف کنید.

استفاده از Hot-Start:

بسیاری از باندهای اضافه در دمای اتاق (هین ستاپ واکنش) تشکیل می‌شوند. آنزیم Hot-Start تا دمای ۹۵ درجه فعال نمی‌شود.