پروتکل کلونینگ ژنی: یک راهنمای تعاملی
کلونینگ ژن یکی از قدرتمندترین تکنیک‌ها در مهندسی ژنتیک است که به ما امکان تکثیر یک قطعه DNA خاص را می‌دهد. این فرآیند، سنگ بنای بسیاری از پیشرفت‌های علمی مدرن است. این راهنمای تعاملی به شما کمک می‌کند تا مراحل پیچیده این پروتکل را به صورت بصری و گام به گام درک کنید. با استفاده از منوی کنار صفحه، بین مراحل جابجا شوید و با جزئیات هر بخش آشنا شوید.
مرور کلی فرآیند کلونینگ
۱. جداسازی ژن
۲. اتصال به وکتور
۳. انتقال به میزبان
۴. تکثیر و انتخاب
۱. جداسازی ژن هدف و انتخاب وکتور
گام اول، جداسازی قطعه DNA مورد نظر (اینسرت) و انتخاب یک حامل (وکتور) مناسب، معمولاً یک پلاسمید، برای انتقال آن به سلول میزبان است. یک وکتور ایده‌آل دارای ویژگی‌های کلیدی است که فرآیند کلونینگ را ممکن می‌سازد. در این بخش، ساختار یک وکتور استاندارد را بررسی می‌کنیم. با نگه داشتن ماوس روی هر بخش، اطلاعات بیشتری کسب کنید.
آناتومی یک وکتور پلاسمیدی
۲. طراحی پرایمر: کلید موفقیت در PCR
طراحی پرایمرهای مناسب، حیاتی‌ترین مرحله برای تکثیر موفق ژن هدف است. پارامترهای مختلفی در این طراحی نقش دارند که عدم توجه به آن‌ها می‌تواند منجر به شکست کل آزمایش شود. نمودار زیر اهمیت نسبی این پارامترها را نشان می‌دهد، که نشان می‌دهد دمای ذوب (Tm) و محتوای GC از اهمیت بالاتری برخوردارند.
اهمیت پارامترهای طراحی پرایمر
۳. تکثیر ژن (PCR) و هضم آنزیمی
پس از طراحی پرایمر، ژن هدف توسط PCR تکثیر می‌شود. سپس، محصول PCR و وکتور باید با آنزیم‌های محدودکننده بریده شوند تا انتهای مکمل و چسبنده برای اتصال ایجاد گردد. این فرآیند دو مرحله‌ای، قطعات را برای مرحله حیاتی بعدی، یعنی لایگیشن، آماده می‌کند.
مراحل آماده‌سازی قطعات
۴. لایگیشن: اتصال دقیق ژن به وکتور
در مرحله لایگیشن، ژن هدف به کمک آنزیم DNA لیگاز به درون وکتور متصل می‌شود. یکی از مهم‌ترین عوامل برای موفقیت این واکنش، نسبت مولی صحیح بین اینسرت (ژن) و وکتور است. نمودار دایره‌ای زیر نشان می‌دهد که معمولاً نسبت ۳ به ۱ (۳ اینسرت به ازای هر ۱ وکتور) بهترین نتیجه را به همراه دارد و شانس موفقیت را به حداکثر می‌رساند.
بهینه‌سازی نسبت مولی در لایگیشن
۵. ترانسفورماسیون: انتقال DNA به سلول میزبان
پس از ساخت پلاسمید نوترکیب، باید آن را به سلول میزبان (معمولاً باکتری E. coli) منتقل کرد. دو روش اصلی برای این کار وجود دارد: شوک حرارتی و الکتروپوریشن. هر روش مزایا و معایب خاص خود را دارد که در جدول زیر با یکدیگر مقایسه شده‌اند.
شوک حرارتی (Heat Shock)
یک روش شیمیایی که با استفاده از یون کلسیم و تغییرات دمایی، غشای سلول را نفوذپذیر می‌کند.
- ✔ تجهیزات ساده و ارزان
- ✔ روش استاندارد و رایج
- ✖ کارایی پایین‌تر نسبت به الکتروپوریشن
الکتروپوریشن (Electroporation)
یک روش فیزیکی که با اعمال یک پالس الکتریکی کوتاه، منافذ موقتی در غشای سلول ایجاد می‌کند.
- ✔ کارایی بسیار بالا
- ✖ نیاز به تجهیزات گران‌قیمت
- ✖ نیاز به خالص‌سازی بالای DNA
۶. غربالگری و انتخاب کلونی‌های موفق
پس از ترانسفورماسیون، باید سلول‌هایی که پلاسمید نوترکیب (حاوی ژن) را دریافت کرده‌اند، شناسایی کنیم. روش غربالگری آبی-سفید یکی از تکنیک‌های رایج برای این کار است. با استفاده از دکمه‌های زیر، نتیجه‌ی یک لایگیشن موفق و ناموفق را در پتری دیش مشاهده کنید.