Real-Time PCR (qPCR) چیست؟
تکنیک qPCR یا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز کمی، به ما اجازه می‌دهد تکثیر DNA را به صورت "زنده" رصد کنیم. با اندازه‌گیری سیگنال فلورسانس در هر چرخه، می‌توانیم مقدار اولیه ماده ژنتیکی را با دقت بالایی تعیین کنیم. کلید درک این تکنیک، شناخت مفهوم **آستانه چرخه (Ct)** است.
نمودار تکثیر تعاملی
اسلایدر زیر را حرکت دهید تا خط آستانه تغییر کند و ببینید چگونه مقدار Ct (نقطه برخورد منحنی با خط) عوض می‌شود.
روش‌های تشخیص: SYBR Green در مقابل پروب
برای تولید سیگنال فلورسانس در qPCR دو راه اصلی وجود دارد. روشی ساده و ارزان با استفاده از رنگ SYBR Green، و روشی بسیار دقیق و اختصاصی با استفاده از پروب‌های TaqMan. با کلیک بر روی هر تب، با جزئیات هر روش آشنا شوید.
روش اول: رنگ SYBR Green I
این رنگ به هر مولکول DNA دو رشته‌ای متصل شده و سیگنال فلورسانس تولید می‌کند. سادگی و هزینه پایین از مزایای اصلی آن است، اما به دلیل اتصال غیراختصاصی، ممکن است نتایج کاذب ایجاد کند.
✅ مزایا
- هزینه بسیار پایین
- سادگی استفاده و عدم نیاز به طراحی پروب
- انعطاف‌پذیری بالا برای اهداف مختلف
❌ معایب
- عدم ویژگی (اتصال به پرایمر-دایمر)
- احتمال نتایج مثبت کاذب
- نیاز به آنالیز منحنی ذوب برای تایید
مقایسه رو در رو
انتخاب روش مناسب به هدف، بودجه و دقت مورد نیاز شما بستگی دارد. در این بخش، ویژگی‌های کلیدی دو روش را برای تصمیم‌گیری بهتر مقایسه می‌کنیم.
اختصاصیت
SYBR Green: پایین
پروب: بسیار بالا
هزینه
SYBR Green: پایین
پروب: بالا
Multiplexing
SYBR Green: خیر
پروب: بله
کنترل کیفی (QC): کلید نتایج قابل اعتماد
بدون کنترل کیفی، نتایج qPCR بی‌اعتبار هستند. مهم‌ترین کنترل، آنالیز منحنی ذوب برای واکنش‌های SYBR Green است. این آنالیز به ما نشان می‌دهد که آیا محصول تکثیر شده، همان محصول مورد نظر ماست یا محصولات جانبی ناخواسته نیز تولید شده‌اند.
آنالیز منحنی ذوب تعاملی
با کلیک بر روی دکمه‌ها، نمودارهای مربوط به نتایج مختلف را مشاهده و مقایسه کنید.
تفسیر نمودار ایده‌آل:
یک پیک واحد و تیز نشان می‌دهد که تنها یک محصول اختصاصی در واکنش تکثیر شده است. این نتیجه مطلوب است.
تفسیر نمودار با پرایمر-دایمر:
وجود یک پیک اضافه در دمای پایین‌تر (معمولا زیر 80°C) نشان‌دهنده تشکیل پرایمر-دایمر است که می‌تواند نتایج را نادرست کند.
سایر کنترل‌های ضروری
کنترل بدون الگو (NTC): باید کاملاً منفی باشد (Ct نداشته باشد). مثبت شدن آن نشانه آلودگی است.
کنترل مثبت: باید تکثیر قابل قبولی نشان دهد و عملکرد صحیح مواد واکنش را تایید می‌کند.
بازده واکنش: بازده ایده‌آل بین ۹۰ تا ۱۱۰ درصد است و با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه می‌شود.
نکات کلیدی برای بهینه‌سازی واکنش
برای دستیابی به بهترین نتایج، بهینه‌سازی هر واکنش ضروری است. در ادامه، چک‌لیستی از مهم‌ترین موارد برای بهینه‌سازی ارائه شده است.
۱. طراحی پرایمر و پروب
پرایمرها باید دمای ذوب (Tm) نزدیک به هم داشته، فاقد ساختارهای ثانویه باشند و به طور اختصاصی به هدف متصل شوند.
۲. کیفیت الگوی اولیه
کیفیت و خلوص DNA یا RNA استخراج شده بسیار مهم است. آلودگی‌ها می‌توانند واکنش را مهار کنند.
۳. غلظت اجزای واکنش
غلظت بهینه پرایمرها، پروب و یون منیزیم (MgCl₂) باید برای هر واکنش به طور تجربی تعیین شود.
۴. پروتکل دمایی
دمای اتصال (Annealing) پرایمرها باید بهینه شود تا از اتصال غیراختصاصی جلوگیری و اتصال اختصاصی تضمین گردد.