راهنمای تعاملی استخراج RNA از مدفوع
راهنمای تعاملی استخراج RNA از مدفوع
یک ابزار جامع برای بهینه‌سازی پروتکل‌ها، انتخاب کیت و عیب‌یابی
مقدمه
استخراج RNA با کیفیت بالا از نمونه‌های مدفوع انسانی، به دلیل وجود مهارکننده‌های متعدد و پیچیدگی ماتریس نمونه، یکی از چالش‌برانگیزترین فرآیندها در زیست‌شناسی مولکولی است. این راهنمای تعاملی طراحی شده تا به محققان و کارشناسان آزمایشگاه کمک کند تا با درک عمیق بهترین شیوه‌ها، انتخاب کیت مناسب و روش‌های عیب‌یابی، به نتایج قابل اعتماد در مطالعات متاترانسکریپتومیکس دست یابند. این ابزار به شما امکان می‌دهد به سرعت بین بخش‌های مختلف جابجا شده و اطلاعات مورد نیاز خود را پیدا کنید.
گردش کار استخراج RNA: از نمونه تا نتیجه
۱. آماده‌سازی نمونه
جمع‌آوری و پایدارسازی
۲. لیز سلولی
تخریب مکانیکی و شیمیایی
۳. خالص‌سازی RNA
جداسازی و شستشو
۴. کنترل کیفیت
بررسی غلظت و تمامیت
برای مشاهده جزئیات بیشتر، روی هر مرحله کلیک کنید.
مقایسه و انتخاب کیت استخراج
انتخاب کیت مناسب، تأثیر مستقیمی بر کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده دارد. کیت‌ها بر اساس فناوری خالص‌سازی (ستون اسپین، ذرات مغناطیسی)، توانایی حذف مهارکننده‌ها و زمان پردازش متفاوت هستند. در این بخش می‌توانید کیت‌های مختلف را بر اساس ویژگی‌های کلیدی مقایسه کرده و بهترین گزینه را برای تحقیق خود انتخاب کنید.
فیلتر کیت‌ها
جدول مقایسه جزئیات کیت‌ها
| نام کیت (سازنده) | فناوری | مقدار نمونه اولیه | زمان پردازش (دقیقه) | ویژگی کلیدی |
|---|
پروتکل‌های گام به گام
در این بخش، پروتکل‌های دقیق و بهینه‌سازی شده برای کیت‌های پیشرو ارائه می‌شود. با انتخاب کیت مورد نظر از منوی زیر، می‌توانید مراحل استخراج را همراه با نکات کلیدی و توصیه‌های کاربران مشاهده کنید.
پروتکل کیت QIAGEN RNeasy PowerMicrobiome
- آماده‌سازی و لیز: تا 0.25 گرم نمونه مدفوع را به تیوب PowerBead اضافه کنید. محلول‌های لیز (مانند PM1) را افزوده و با استفاده از Bead Beater به مدت 5-10 دقیقه هموژن کنید. نکته کلیدی: از افزودن نمونه بیش از حد خودداری کنید.
- حذف مهارکننده‌ها (IRT): سانتریفیوژ کرده و سوپرناتانت را به تیوب جدید منتقل کنید. محلول حذف مهارکننده (PM2) را اضافه کرده و مجدداً سانتریفیوژ کنید. سوپرناتانت شفاف را برای مرحله بعد بردارید.
- اتصال RNA به ستون: بافر اتصال (PM3) و اتانول 100% را اضافه کنید. مخلوط را به ستون اسپین RNeasy منتقل کرده و سانتریفیوژ کنید تا RNA به غشای سیلیکا متصل شود.
- هضم gDNA روی ستون: مخلوط آنزیم DNase I را مستقیماً روی غشای ستون ریخته و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. مرحله حیاتی: این مرحله برای مطالعات بیان ژن ضروری است.
- شستشو: با استفاده از بافرهای شستشو (PM4, RPE)، نمک‌ها و آلودگی‌ها را حذف کنید. در انتها، یک مرحله "سانتریفیوژ خشک" (Dry Spin) به مدت 2-5 دقیقه انجام دهید تا تمام اتانول باقی‌مانده حذف شود.
- استخراج (Elution): 30-100 میکرولیتر آب RNase-free را به مرکز غشا اضافه کرده و با سانتریفیوژ، RNA خالص را استخراج کنید. نکته کاربر: برای افزایش بازده، آب را قبل از استفاده تا دمای 55-60 درجه سانتی‌گراد گرم کنید.
کنترل کیفیت (QC) و عیب‌یابی
پس از استخراج، ارزیابی کمیت، خلوص و تمامیت RNA ضروری است. در این بخش، شاخص‌های کلیدی QC را به صورت بصری بررسی کرده و راهکارهای عملی برای شایع‌ترین مشکلات ارائه می‌شود.
خلوص RNA (نسبت‌های اسپکتروفتومتری)
تمامیت RNA (RIN)
راهنمای عیب‌یابی سریع
پرسش‌های متداول (FAQ)
پاسخ به سوالات رایجی که در حین کار در آزمایشگاه با آنها مواجه می‌شوید.
