دروازه‌ای به اطلاعات ژنتیکی خون
استخراج DNA از خون، سنگ بنای بسیاری از تحقیقات پزشکی و تشخیص‌های بالینی است. این فرآیند، اطلاعات ژنتیکی ارزشمندی را به دو شکل اصلی در اختیار ما قرار می‌دهد: DNA ژنومیک از سلول‌های سفید و DNA آزاد از پلاسما. درک تفاوت این دو و انتخاب روش صحیح استخراج، کلید دستیابی به نتایج دقیق و قابل اعتماد است.
DNA ژنومیک (gDNA) از نمونه خون کامل
این DNA از هسته سلول‌های سفید خون (لکوسیت‌ها) استخراج می‌شود و حاوی مجموعه کامل دستورالعمل‌های ژنتیکی یک فرد است. gDNA مولکولی طویل و با وزن مولکولی بالا است که برای مطالعات ژنتیک مندلی، تعیین هویت، و بررسی‌های جامع ژنومیک به کار می‌رود.
DNA آزاد (cfDNA) از پلاسما
این مولکول‌ها، قطعات کوتاه DNA هستند که پس از مرگ سلولی در جریان خون آزاد می‌شوند. cfDNA انقلابی در زمینه تشخیص‌های غیرتهاجمی مانند “بیوپسی مایع” برای ردیابی تومورهای سرطانی و غربالگری ناهنجاری‌های جنین ایجاد کرده است.
استخراج DNA ژنومیک از نمونه خون کامل (Whole Blood)
چالش اصلی در این نمونه، حذف گلبول‌های قرمز فراوان و بدون هسته برای دسترسی به گلبول‌های سفید است. در این بخش، پروتکل گام به گام با استفاده از کیت‌های ستونی مدرن را به صورت تعاملی بررسی می‌کنیم.
نگاه تئوری:
این مرحله بر اساس “شوک اسمزی” عمل می‌کند. بافر لیز کننده گلبول قرمز (محلول هیپوتونیک) باعث هجوم آب به داخل سلول‌های قرمز و پارگی آن‌ها می‌شود، در حالی که گلبول‌های سفید مقاوم‌تر باقی می‌مانند.
نگاه عملی:
بافر لیز به نمونه خون اضافه شده و پس از انکوباسیون کوتاه، سانتریفیوژ می‌شود. پلت (رسوب) سفیدرنگ گلبول‌های سفید در ته لوله باقی می‌ماند و محلول رویی قرمز رنگ (بقایای گلبول‌های قرمز) دور ریخته می‌شود.
نمای شماتیک
قبل از لیز
بعد از لیز
پلت سفید WBC در ته لوله
نگاه تئوری:
بافر لیز سلولی (حاوی دترجنت و نمک‌های کائوتروپیک) غشای سلولی و هسته WBC را می‌شکند. آنزیم پروتئیناز K پروتئین‌ها، به ویژه هیستون‌ها و نوکلئازهای مخرب را هضم کرده و DNA را آزاد می‌کند.
نگاه عملی:
پروتئیناز K به پلت WBC اضافه شده و در دمای بالا (معمولاً 56 درجه سانتی‌گراد) انکوبه می‌شود. این کار لیز کامل سلول و آزادسازی DNA را تضمین می‌کند.
نگاه تئوری:
در حضور غلظت بالای نمک و اتانول، DNA با بار منفی به غشای سیلیکای ستون با بار مثبت متصل می‌شود. سایر مولکول‌ها تمایل کمتری برای اتصال دارند.
نگاه عملی:
اتانول به محلول لیز شده اضافه شده، مخلوط به ستون منتقل و سانتریفیوژ می‌شود. DNA به غشا می‌چسبد و مایع از ستون عبور می‌کند.
نگاه تئوری:
بافرهای شستشو (حاوی اتانول) آلاینده‌ها مانند نمک و پروتئین را از ستون می‌شویند، در حالی که DNA محکم به غشا متصل باقی می‌ماند.
نگاه عملی:
معمولاً دو مرحله شستشو انجام می‌شود. گام حیاتی در انتها، “سانتریفیوژ خشک” برای حذف کامل اتانول باقی‌مانده است، زیرا اتانول مهارکننده قوی PCR است.
نگاه تئوری:
با افزودن یک بافر با غلظت نمک پایین (مانند آب مقطر یا بافر TE)، اتصال بین DNA و سیلیکا شکسته شده و DNA از غشا جدا و وارد محلول می‌شود.
نگاه عملی:
برای افزایش بازده، بافر استخراج را پیش‌گرم کنید (65-70 درجه). پس از افزودن بافر، چند دقیقه انکوبه کنید تا DNA کاملاً حل شود. استفاده از حجم کمتر بافر، غلظت DNA را افزایش می‌دهد.
استخراج DNA آزاد (cfDNA) از پلاسما
استخراج cfDNA به دلیل غلظت بسیار پایین و خطر آلودگی با DNA ژنومیک، نیازمند دقت و پروتکل‌های تخصصی است. گام اول، یعنی جداسازی صحیح پلاسما، حیاتی‌ترین مرحله است.
این مرحله برای به حداقل رساندن آلودگی با gDNA حاصل از لیز شدن ناخواسته گلبول‌های سفید ضروری است.
خون کامل در لوله EDTA
سانتریفیوژ اول
(دور پایین: 1,600g)
انتقال دقیق پلاسما
(بدون تماس با لایه Buffy Coat)
سانتریفیوژ دوم
(دور بالا: 16,000g)
پلاسمای خالص و عاری از سلول
(آماده برای استخراج)
اصول این مراحل مشابه استخراج gDNA است اما با تفاوت‌های کلیدی برای کار با cfDNA:
- حجم ورودی بزرگ: معمولاً از حجم‌های بزرگ پلاسما (1 تا 5 میلی‌لیتر) استفاده می‌شود.
- تکنولوژی اتصال بهینه: اغلب از دانه‌های مغناطیسی (Magnetic Beads) به جای ستون استفاده می‌شود که برای جذب قطعات کوچک DNA کارآمدتر است.
- بافرهای بهینه‌سازی شده: ترکیبات بافرها برای بازدهی حداکثری قطعات کوچک DNA تنظیم شده‌اند.
- حجم استخراج بسیار کم: برای تغلیظ cfDNA، استخراج نهایی در حجم‌های بسیار کم (15 تا 50 میکرولیتر) انجام می‌شود.
هشدار: استفاده از کیت استخراج gDNA معمولی برای cfDNA به هیچ وجه توصیه نمی‌شود و منجر به از دست رفتن بخش عمده‌ای از cfDNA می‌شود.
مقایسه روش‌ها: کیت ستونی در مقابل فنل-کلروفرم
انتخاب بین روش‌های مدرن مبتنی بر کیت و روش کلاسیک فنل-کلروفرم به عوامل مختلفی بستگی دارد. برای آشنایی کامل و مقایسه جامع این دو تکنیک، می‌توانید راهنمای تعاملی ما در مورد خالص‌سازی DNA را مطالعه کنید.
| ویژگی | روش کیت ستونی | روش فنل-کلروفرم |
|---|---|---|
| سرعت و راحتی | بسیار سریع (کمتر از 1 ساعت)، پروتکل استاندارد و ساده. | بسیار زمان‌بر (چندین ساعت)، نیازمند مهارت بالا. |
| ایمنی | بسیار ایمن، عدم استفاده از حلال‌های سمی. | بسیار خطرناک، نیازمند هود شیمیایی و تجهیزات حفاظت فردی کامل. |
| بازده (Yield) | خوب تا عالی، بازده ثابت و قابل تکرار. | بالقوه بسیار بالا، اما به مهارت کاربر وابسته است. |
| خلوص (Purity) | خلوص بسیار بالا، آماده برای کاربردهای حساس. | ریسک بالای آلودگی با فنل (مهارکننده آنزیم‌ها). |
| هزینه | هزینه اولیه به ازای هر نمونه بالاتر است. | هزینه مواد اولیه پایین‌تر، اما هزینه‌های پنهان (ایمنی، دفع پسماند) بالا است. |
سوالات متداول (FAQ)
پاسخ به برخی از رایج‌ترین سوالات در زمینه استخراج DNA از خون.
پس از سانتریفیوژ، پلاسمای سالم باید به رنگ زرد کم‌رنگ و شفاف باشد. اگر پلاسما به رنگ صورتی، قرمز یا قهوه‌ای درآمده باشد، نشان‌دهنده همولیز (پارگی گلبول‌های قرمز) است. همولیز می‌تواند با تست‌های بعدی تداخل ایجاد کند.
EDTA بهترین و استانداردترین ضدانعقاد است، زیرا با به دام انداختن یون‌های منیزیم، آنزیم‌های تجزیه‌کننده DNA (DNases) را مهار می‌کند. باید از لوله‌های حاوی هپارین به شدت اجتناب کرد، زیرا مهارکننده قوی واکنش PCR است.
خیر. این کار به هیچ وجه توصیه نمی‌شود. کیت‌های استاندارد برای جداسازی مولکول‌های بزرگ DNA طراحی شده‌اند و بخش عمده‌ای از قطعات کوتاه cfDNA را از دست خواهند داد. برای استخراج cfDNA باید حتماً از کیت‌های تخصصی که برای این منظور طراحی شده‌اند (معمولاً مبتنی بر دانه‌های مغناطیسی) استفاده کرد.