راهنمای جامع PCR و qPCR
راهنمای جامع PCR و qPCR
کاوشی تعاملی در دنیای تکثیر اسید نوکلئیک. در این راهنما، به صورت پویا با تفاوت‌های بنیادین، کاربردها، پروتکل‌های عملی و نکات کلیدی دو تکنیک قدرتمند PCR سنتی و Real-Time PCR آشنا خواهید شد.
مقایسه اصول: کیفی در برابر کمی
با کلیک بر روی دکمه زیر، بین نمایش شماتیک PCR سنتی و qPCR جابجا شوید و تفاوت اصلی در نحوه تشخیص محصول را به صورت بصری درک کنید. PCR در نقطه پایانی نتیجه را مشخص می‌کند، در حالی که qPCR واکنش را به صورت زنده رصد می‌کند.
۱. واسرشت‌سازی (Denaturation)
DNA دو رشته‌ای در دمای بالا (~$95^{\circ}C$) به دو رشته مجزا تبدیل می‌شود.
۲. اتصال پرایمر (Annealing)
در دمای پایین‌تر (~$55-65^{\circ}C$)، پرایمرها به نواحی هدف متصل می‌شوند.
۳. طویل‌سازی (Extension)
آنزیم پلیمراز در دمای ~$72^{\circ}C$ رشته‌های جدید را سنتز می‌کند.
نتیجه‌گیری در نقطه پایانی
پس از اتمام تمام چرخه‌ها، محصول نهایی روی ژل الکتروفورز بررسی می‌شود. این یک تحلیل کیفی است: آیا محصول وجود دارد یا خیر؟
۱. واسرشت‌سازی (Denaturation)
مشابه PCR، در دمای ~$95^{\circ}C$.
۲. اتصال و طویل‌سازی
این دو مرحله اغلب در یک دما (~$60^{\circ}C$) انجام می‌شوند.
۳. خوانش فلورسانس
در پایان هر چرخه، سیگنال فلورسنت (ناشی از رنگ یا پروب) اندازه‌گیری می‌شود.
اندازه‌گیری در زمان واقعی
با رصد زنده فلورسانس، مقدار اولیه الگو به صورت کمی (مقدار Cq) تعیین می‌شود. هرچه Cq پایین‌تر باشد، مقدار الگو بیشتر است.
مقایسه ویژگی‌ها در یک نگاه
کاربردها: ساختن در برابر اندازه‌گیری
PCR سنتی عمدتاً برای تولید DNA به عنوان ماده اولیه استفاده می‌شود، در حالی که qPCR برای اندازه‌گیری دقیق کمیت اسید نوکلئیک به کار می‌رود. برای مشاهده کاربردهای هرکدام، روی کارت‌های زیر کلیک کنید.
کاربردهای PCR سنتی
متمرکز بر تولید انبوه DNA، جایی که کمیت اولیه اهمیتی ندارد.
کاربردهای qPCR
متمرکز بر اندازه‌گیری دقیق و حساس، از بیان ژن تا تشخیص بیماری.
پروتکل‌های عملی و تعاملی
در این بخش، پروتکل‌های گام به گام برای دو کیت متداول ارائه شده است. از تب‌ها برای جابجایی بین پروتکل‌ها و از ماشین حساب برای محاسبه سریع حجم مواد اولیه استفاده کنید.
مراحل آماده‌سازی واکنش (حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر)
- تمام اجزا (مسترمیکس، پرایمر، الگو، آب) را روی یخ ذوب کنید.
- محلول‌ها را به آرامی مخلوط و سانتریفیوژ کوتاه کنید.
- مواد را طبق جدول (یا ماشین حساب) در تیوب PCR بریزید.
- مخلوط را در ترموسایکلر با برنامه دمایی مناسب قرار دهید.
برنامه دمایی استاندارد
- واسرشت‌سازی اولیه: $94^{\circ}C$ برای ۳-۵ دقیقه
- چرخه‌ها (۲۵-۳۵ بار):
- – واسرشت‌سازی: $94^{\circ}C$ برای ۳۰ ثانیه
- – اتصال: $55-65^{\circ}C$ برای ۳۰ ثانیه
- – طویل‌سازی: $72^{\circ}C$ برای ۳۰-۶۰ ثانیه به ازای هر kb
- طویل‌سازی نهایی: $72^{\circ}C$ برای ۵ دقیقه
ماشین حساب واکنش PCR
مراحل آماده‌سازی واکنش (حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر)
- تمام اجزا را روی یخ و دور از نور ذوب کنید.
- برای تمام نمونهها و کنترلها (شامل NTC) مسترمیکس کلی تهیه کنید (۱۰٪ حجم اضافی).
- مواد را طبق جدول (یا ماشین حساب) در چاهکهای پلیت qPCR بریزید.
- پلیت را با پوشش مخصوص مهر و موم کرده و سانتریفیوژ کنید.
برنامه دمایی استاندارد
- فعالسازی آنزیم: $95^{\circ}C$ برای ۱۰ دقیقه
- چرخه‌ها (۳۰-۴۰ بار):
- – واسرشت‌سازی: $95^{\circ}C$ برای ۱۵ ثانیه
- – اتصال/طویل‌سازی: $60^{\circ}C$ برای ۶۰ ثانیه (خوانش فلورسانس)
- آنالیز منحنی ذوب: طبق برنامه استاندارد دستگاه
ماشین حساب واکنش qPCR
راهنمای عیب‌یابی سریع qPCR
با مشکلات رایج در qPCR مواجه شده‌اید؟ روی هر یک از موارد زیر کلیک کنید تا دلایل احتمالی و راه‌حل‌های پیشنهادی را مشاهده نمایید.
بهترین شیوه‌ها برای نتایج قابل اعتماد
حساسیت بالای qPCR نیازمند رعایت دقیق اصول آزمایشگاهی است. در اینجا به چند نکته کلیدی برای جلوگیری از خطا و آلودگی اشاره می‌شود.
جداسازی فضا
از فضاهای مجزا برای آماده‌سازی معرف‌ها (Pre-PCR)، افزودن الگو و آنالیز محصولات (Post-PCR) استفاده کنید تا از آلودگی جلوگیری شود.
نوک پیپت فیلتردار
استفاده از نوک پیپت‌های فیلتردار برای جلوگیری از ورود آئروسل به داخل پیپت و آلودگی متقاطع، یک امر ضروری است.
کنترل‌های کیفی
همیشه از کنترل بدون الگو (NTC)، تکرارهای فنی و ژن‌های مرجع معتبر برای اطمینان از صحت و اعتبار نتایج خود استفاده کنید.
